Genomredigeringstekniker som CRISPR-Cas9 har revolutionerat biologi, medicin och jordbruk, men det finns fortfarande farhågor om oavsiktliga redigeringar på felaktiga DNA-ställen. Dessa felaktiga effekter kan orsaka skadliga mutationer och är svåra att förutsäga, eftersom de inte bara beror på guide-RNA utan också på organismens unika genetiska uppsättning. De flesta befintliga prediktionsverktyg bygger på ett standardreferensgenom och bortser från viktiga variationer som SNP, insertioner och deletioner som skiljer sig mellan individer och alleler.
För att lösa detta problem har forskare under ledning av professor Jeongbin Park från Pusan National University utvecklat Variant-aware Cas-OFFinder, ett webbaserat verktyg som förbättrar prediktionen av off-target-ställen genom att ta hänsyn till individuella genetiska variationer. Medförfattarna Abyot Melkamu Mekonnen (doktorand) och Kang Seong (dåvarande student, nu masterstudent vid KAIST), som genomförde studien vid Pusan National University, säger: ”Det är mycket givande att veta att den teknik vi har utvecklat kan vara till praktisk hjälp för att korrigera enskilda gener.”
Verktyget testades med hjälp av människans genom och paprikasorter. Deras resultat publicerades online den 8 maj 2025 i tidskriften Nucleic Acids Research.
Verktyget Variant-aware Cas-OFFinder innebär ett betydande steg framåt inom personlig genomredigering genom att direkt integrera genetisk mångfald i förutsägelser av off-target-effekter. Det accepterar fasade VCF-filer med ett enda prov och stöder GPU-acceleration, vilket möjliggör tillämpning utanför standardmodeller. Genom att rekonstruera allelspecifika genomsekvenser utför verktyget haplotyp-nivåanalys, vilket ger en detaljerad och korrekt bild av potentiella off-target-effekter.
”Enligt min mening bör verktyg för genomredigering vara lika individualiserade som de genom de riktar sig mot”, säger professor Park. ”Vårt verktyg lägger grunden för mer exakta och personaliserade redigeringsstrategier.”
Teamet testade verktyget på genom från människor och paprika (Capsicum annuum) med hjälp av offentliga och sortsspecifika sekvenseringsdata. Hos människor avslöjade det off-target-platser på kromosom 10 som saknades i standardreferensgenomet. Hos paprika identifierade det distinkta allelspecifika off-targets, vilket är användbart för växtförädling.
Jämfört med befintliga verktyg som Cas-OFFinder och CRISPRitz identifierade Variant-aware Cas-OFFinder konsekvent unika off-targets orsakade av små varianter såsom insertioner och deletioner. Även om det ännu inte detekterar stora strukturella varianter, stöder det 557 arter och 40 PAM-typer och är helt anpassningsbart genom YAML-filer.
”Precisionsgenomredigering kräver precisionsverktyg”, säger professor Park. ”Vi tror att Variant-aware Cas-OFFinder kommer att spela en central roll i utvecklingen av säkrare och effektivare CRISPR-terapier och jordbruksapplikationer.”
Verktyget finns både som ett användarvänligt webbgränssnitt och en kommandoradsversion. Dess källkod, benchmarkverktyg och exempeldataset är fritt tillgängliga på GitHub och Zenodo. Även om dess haplotyp-nivåanalys kan göra prestandan något långsammare jämfört med tidigare verktyg, möjliggör denna kompromiss större noggrannhet och tillförlitlighet i genredigeringsforskningen.
Mer information: Abyot Melkamu Mekonnen et al, Variant-aware Cas-OFFinder: webbaserad in silico-variantmedveten identifiering av potentiella off-target-ställen för genredigeringsapplikationer, Nucleic Acids Research (2025). DOI: 10.1093/nar/gkaf389
