Proteiner med inre oordning (IDP:er) kan dynamiskt ändra sin konformation beroende på den yttre miljön och kan därför binda till olika ämnen. De är dock svåra att analysera. Nu har Tokyo Tech-forskare tagit itu med denna fråga med en ny pipeline som möjliggör en snabb kristallstrukturanalys av IDP:er via en cellfri proteinkristalliseringsteknik.
För många är det lättare att tänka på proteiner som någon form av stelbent ”molekylärt maskineri”, där varje protein har en väldefinierad struktur som möjliggör eller kompletterar dess funktioner. Många viktiga proteiner saknar dock en sådan fast tredimensionell struktur. Istället kan dessa så kallade intrinsically disordered proteins (IDPs) anta ett stort antal olika konformationer baserat på deras yttre miljö. Denna inneboende flexibilitet hos IDP:er gör dem mångsidiga och i allmänhet kapabla att binda till många olika föreningar.
Jämfört med andra typer av proteiner kan IDP:er vara ganska svåra att analysera. För att förstå de biologiska funktionerna hos en IDP är det viktigt att identifiera de faktorer – eller determinanter – som kan stabilisera dess subregioner på atomnivå. En framträdande metod för att uppnå detta är att immobilisera en mål-IDP genom att låta den binda till en proteinkristallställning, vilket möjliggör användning av proteinkristallografiska tekniker. De metoder som för närvarande finns tillgängliga för detta är dock ganska långsamma och obekväma att använda.
Mot denna bakgrund har ett forskarteam under ledning av professor Takafumi Ueno från School of Life Science and Technology och International Research Frontiers Initiative (IRFI), båda vid Tokyo Institute of Technology (Tokyo Tech), Japan, försökt ta fram en mer tillförlitlig och mångsidig metod. I sin senaste studie, som publicerats i Proceedings of the National Academy of Sciences, rapporterar de om utvecklingen av en innovativ pipeline för snabb kristallstrukturanalys av IDP:er.
En av höjdpunkterna i denna pipeline är dess användning av en cellfri proteinkristalliseringsmetod (CFPC) för att få en önskad IDP att binda till en byggnadsställningskristall. För att illustrera användningen av pipelinen fokuserade forskarna sina ansträngningar på ett fragment av c-Myc, en IDP från en familj av gener som reglerar cellcykelprogression, apoptos och andra cellulära funktioner.
Med hjälp av Foldit, ett program för prediktion av proteinstrukturer, utformade teamet en polyhedrakristall (PhC) från en insektscell som en byggnadsställning som c-Myc-fragmenten skulle binda till. För att påskynda korskristalliseringen mellan PhC och c-Myc-fragment framställde forskarna c-Myc-fusionerat monomert PhC-mRNA och blandade det i ett system som innehöll cellextrakt och byggstenarna i PhC.
Eftersom cellextrakten innehåller det nödvändiga cellulära maskineriet för att transkribera mRNA kan detta system producera stora mängder c-Myc-fusionerade PhC utan att förlita sig på levande celler, vilket avsevärt påskyndar stabiliseringen av IDP och förenklar dess efterföljande extraktion för analys.
När de kristalliserade c-Myc-fragmenten hade analyserats använde forskarna molekylärdynamiksimulering för att strategiskt införa mutationer i c-Myc-genen innan de upprepade de tidigare nämnda stegen. Genom att jämföra hur de modifierade fragmenten band till PhC-ställningen och de strukturer som bildades kunde teamet fastställa vilka nyckelrester som i slutändan styrde stabiliseringen av c-Myc.
”Dessa resultat understryker styrkan i vår CFPC-screeningmetod som ett värdefullt verktyg för att bestämma strukturerna hos utmanande målproteiner och belysa de väsentliga molekylära interaktioner som styr deras stabilitet”, säger Ueno.
Den föreslagna strategin kan vara till stor nytta vid studier av biomolekylär bindning, vilket är en grundläggande aspekt inom områden som medicin och cellbiologi.
”Vårt screening-system kommer att användas för att rikta in sig på IDP:er vars bindningspartners ännu inte har identifierats och för att utforma nya bindningsmolekyler, t.ex. inhibitorer”, säger Ueno. ”Dessutom skulle den snabba screeningen av kristallstrukturer kunna göra det möjligt för oss att konstruera ett designbibliotek av proteinkristaller, vilket skulle påskynda kartläggningen av IDP-veckningsmekanismer.”
Ytterligare information: Mariko Kojima et al, High-throughput structure determination of an intrinsically disordered protein using cell-free protein crystallization, Proceedings of the National Academy of Sciences (2024). DOI: 10.1073/pnas.2322452121
