Lipidnanopartiklar (LNP) är transportmedel inom modern medicin som för cancerläkemedel, genterapi och vacciner till cellerna. Fram till nyligen antog många forskare att alla LNP följde ungefär samma mönster, precis som en flotta lastbilar byggda efter samma design.
Nu har forskare från University of Pennsylvania, Brookhaven National Laboratory och Waters Corporation i tidskriften Nature Biotechnology karakteriserat formen och strukturen hos LNP i oöverträffad detalj och avslöjat att partiklarna finns i en överraskande mångfald av konfigurationer.
Denna mångfald är inte bara kosmetisk: Som forskarna fann korrelerar partiklarnas inre form och struktur med hur väl de transporterar terapeutisk last till en viss destination.
”Att behandla LNP som en enda bilmodell har fungerat, vilket bevisas av de miljontals människor som dessa partiklar har hjälpt, men LNP är inte en universallösning för alla RNA-behandlingar”, säger Michael J. Mitchell, docent i bioteknik vid Penn Engineering och medförfattare till artikeln.
”Precis som pickuper, leveransbilar och lastbilar passar bäst för olika resor, kan vi nu börja anpassa LNP-designen till specifika terapier och vävnader, vilket gör dessa partiklar ännu effektivare.”
”Dessa resultat ger en mer grundläggande förståelse för hur sammansättningen och formen på dessa terapeutiska partiklar relaterar till deras biologi”, tillägger Kushol Gupta, forskningsassistent i biokemi och biofysik vid Penns Perelman School of Medicine och den andra medförfattaren till artikeln.
”Dessa partiklar har redan bevisat sin effektivitet i kliniken, och dessa insikter kommer att göra dem ännu mer kraftfulla genom att hjälpa oss att snabbare skräddarsy leveransen till specifika sjukdomar.”
Belysa den svarta lådan
Under de senaste åren har bland annat Mitchell Lab upptäckt att olika LNP-formuleringar har olika biologiska effekter. Tillsats av fenolgrupper minskar till exempel inflammation, medan förgrenade joniserbara lipider förbättrar leveransen.
”Det är nästan som att utveckla recept”, säger Marshall Padilla, postdoktor i bioteknik och försteförfattare till den nya artikeln. ”Vi har vetat att olika ingredienser och tekniker förändrar resultaten.”
Men det har visat sig svårt att förstå varför vissa kemiska justeringar leder till särskilda biologiska effekter. ”Dessa partiklar är något av en ’svart låda’”, tillägger Padilla. ”Vi har varit tvungna att utveckla nya formuleringar främst genom trial and error.”
De varierande formerna och strukturerna hos lipidnanopartiklar kan leda till smartare läkemedel. Källa: Bella Ciervo
LNP i fokus
För att visualisera partiklarna använde forskarna flera tekniker. Tidigare studier har däremot vanligtvis förlitat sig på en enda metod, till exempel att frysa partiklarna på plats.
På grund av partiklarnas storlek – det skulle krävas tusentals LNP för att omsluta ett människohår – märkte man i tidigare arbeten ofta partiklarna med fluorescerande material och gjorde genomsnittliga mätningar, med risken att partiklarnas form förändrades och variationer döljes.
”Vi behövde kombinera flera, i grunden olika tekniker som lämnade partiklarna intakta i lösningen”, säger Gupta. ”På så sätt kunde vi vara säkra på att överensstämmelsen mellan metoderna visade oss hur partiklarna verkligen såg ut.”
Tre tekniker, en studie
Forskarna undersökte fyra ”guldstandard”-LNP-formuleringar, inklusive de som används i COVID-19-vaccinerna och Onpattro, en FDA-godkänd behandling för en sällsynt genetisk sjukdom.
En visualiseringsteknik, sedimentationshastighetsanalytisk ultracentrifugering (SV-AUC), innebar att LNP:erna centrifugerades med hög hastighet för att separeras efter densitet.
En annan teknik, fältflödesfraktionering i kombination med multi-vinkel ljusspridning (FFF-MALS), separerade försiktigt LNP:erna efter storlek och mätte hur nukleinsyran fördelades över de olika partiklarna.
Utrustning i National Synchrotron Light Source II. Källa: Timothy Kuhn/Brookhaven National Laboratory
En tredje teknik, storleksutskiljningskromatografi i linje med synkrotron småvinkelröntgenspridning (SEC-SAXS), gjorde det möjligt för forskarna att studera LNP:ernas inre struktur genom att bestråla dem med kraftfulla röntgenstrålar vid National Synchrotron Light Source II (NSLS-II), en användaranläggning tillhörande U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science användaranläggning vid DOE:s Brookhaven National Lab.
”Vi brukade tro att LNP såg ut som kulor”, säger Gupta och sammanfattar resultaten. ”Men de liknar faktiskt mer gelébönor, oregelbundna och varierande, även inom samma formulering.”
Kraften i samarbete
Resultaten hade varit omöjliga att uppnå utan samarbete mellan akademin, industrin och ett nationellt laboratorium.
”Vi har utvecklat metoder för att mäta både storleken på lipidnanopartiklar och deras läkemedelsinnehåll utan att bryta sönder partiklarna”, säger Martin Kurnik, Wyatt Technology Principal Scientist vid Waters Corporation, som ledde FFF-MALS-experimenten.
”Kapaciteten vid Brookhaven National Lab möjliggjorde ett unikt experiment som kombinerade röntgenstrålning med ultraviolett ljus för att kvantifiera partiklarnas geometriska egenskaper”, tillägger James Byrnes, strålningsforskare vid NSLS-II, som genomförde SEC-SAXS-experimenten.
”Detta banar väg för att karakterisera partikelformuleringar i stor skala och belyser den spännande potentialen för ett djupare samarbete mellan synkrotronanläggningar och LNP-utvecklare.”
”Hela projektet visar på kraften i att olika institutioner samlar sina resurser och sin expertis”, säger Padilla. ”Vi kunde bara visualisera partiklarna i sådan detalj eftersom varje partner såg dem från olika vinklar.”
En flygbild över Brookhaven National Laboratory. Källa: Kevin P. Coughlin / Brookhaven National Laboratory
Testa effekterna
När forskarna hade karakteriserat LNP-formuleringarna testade de deras effekter på en rad olika mål, från humana T-celler och cancerceller till djurmodeller.
Hannah Yamagata, doktorand vid Mitchell Lab, fann att vissa partiklarnas interna strukturer motsvarade förbättrade resultat, till exempel att mer last lossades eller att fler leveranser nådde målet. ”Intressant nog varierade det beroende på sammanhanget”, säger Yamagata.
Vissa LNP-formuleringar fungerade bättre i immunceller, medan andra visade större potens i djurmodeller. ”Rätt modell av LNP beror på destinationen”, tillägger Yamagata.
Blanda rätt sats
Forskarna märkte också att partiklarnas egenskaper – och potens – varierade beroende på vilken metod de använde för att framställa LNP:erna.
Mikrofluida enheter, som pressar ingredienserna genom små rör, ledde till mer enhetliga former och storlekar, medan blandning för hand med mikropipetter resulterade i större variation.
Hittills hade forskarna antagit att mikrofluida enheter fungerade bättre, men Yamagata såg att mikropipettering gav bättre resultat i vissa fall.
”Det är ungefär som att baka kakor”, säger hon. ” Man kan använda samma ingredienser, men om man förbereder dem på olika sätt får slutprodukten en annan struktur.”
Från vänster: doktoranden Hannah Yamagata, forskningsassistent Kushol Gupta och postdoktoranden Marshall Padilla håller i 3D-printade modeller av nanopartiklar. Foto: Bella Ciervo
Framtida inriktning
Resultaten öppnar dörren till en ny era av rationell LNP-design, som går bortom dagens trial-and-error-metod.
I stället för att utgå från en enda ”bästa” formulering visar studien att partikelstorlek, form, inre struktur och beredningsmetod måste anpassas till den terapeutiska kontexten. ”Det finns ingen LNP som passar alla”, säger Yamagata. ”Varje detalj påverkar deras form och struktur, och formen och strukturen påverkar deras funktion.”
Även om vissa av de verktyg som användes i experimenten – till exempel en partikelaccelerator – är svåra att få tillgång till, kan många av stegen reproduceras med mer vanlig utrustning. Allteftersom fler laboratorier genererar strukturella och funktionella data kan området till och med sammanställa de datamängder som behövs för att träna AI för LNP-design.
I slutändan pekar resultaten mot en framtid där nanopartiklar kan konstrueras med samma precision som läkemedel. ”Denna artikel ger en vägkarta för att designa LNP mer rationellt”, säger Mitchell.
