Under de senaste åren har teknik som gör det möjligt för forskare att studera en persons DNA med enmolekylupplösning avsevärt ökat vår kunskap om det mänskliga genomet, mikrobiomet och den genetiska grunden för sjukdomar. Med en så detaljerad bild av DNA är det möjligt att se genetiska varianter och strukturella detaljer som helt enkelt var omöjliga att upptäcka med tidigare sekvenseringstekniker.
Dagens standardmetoder för analys av enstaka molekyler kräver dock minst 150 000 mänskliga celler, som innehåller miljontals enskilda DNA-molekyler. Det innebär att forskarna inte kan använda dessa verktyg när bara några tusen celler finns tillgängliga, som i många tumörbiopsier, vilket begränsar den vetenskapliga och kliniska potentialen för dessa tekniker.
Nu har forskare vid Gladstone Institutes utvecklat två nya verktyg för analys av enstaka molekyler som minskar mängden DNA som behövs med 90 till 95%. Deras arbete, som publiceras i tidskriften Nature Genetics, visar hur dessa verktyg kan göra det möjligt för forskare att ta itu med biologiska frågor som de tidigare inte har kunnat besvara.
”Vi har arbetat för att skapa dessa metoder under mycket lång tid”, säger Vijay Ramani, Ph.D., biträdande utredare vid Gladstone och huvudförfattare till studien. ”Vi ser verkligen fram emot att se vilka upptäckter som nu kommer att bli möjliga.”
”Taggning” av DNA för en klarare bild
Det första av de nya verktygen, som kallas ”single-molecule real time sequencing by tagmentation”, eller SMRT-Tag, utökar de etablerade protokollen för samtidig kartläggning av bassekvensen i ett långt DNA-fragment och placeringen av kemiska strukturer som kallas metylgrupper, som ligger längs DNA:t. Metylgrupper spelar en nyckelroll i genuttryck, vilket gör dem viktiga för att förstå sjukdomar, så det är viktigt att se hur de är konfigurerade på DNA.
”När vi har väldigt lite DNA att arbeta med kan vi inte bara göra fler kopior av DNA:t och tillämpa våra vanliga protokoll”, säger Ramani. ”Att göra kopior skulle ta bort dessa metyleringsmönster och införa andra fel.”
Istället använde hans team en metod som kallas ”taggning”, där bakterieproteinet Tn5 används för att samtidigt klippa DNA-molekyler i mer hanterbara fragment och märka dem med kemiska komponenter som behövs för vidare analys.
Tagmentering används redan för sekvensering av korta DNA-fragment när endast små mängder DNA finns tillgängliga – men endast begränsad information kan utläsas ur korta fragment.
Utmaningen för Ramanis team var att få biokemin för taggning att passa perfekt för att bryta upp små mängder DNA till långa bitar på cirka 3.000 till 5.000 baspar. Deras metod ”taggar” ändarna på varje fragment med hårnålsformade strukturer, vilket skapar långa slingor av DNA som kan läsas på ett tillförlitligt sätt av sekvenseringsmaskiner.
”Det var en ganska heroisk insats av personalen och studenterna i mitt labb”, säger Ramani. ”Vi var tvungna att testa olika versioner av Tn5 och nästan 100 olika förhållanden med olika buffertar, enzymer och temperaturer. När man arbetar med så små mängder DNA är varje problem som orsakar DNA-förlust ett ännu större problem.”
Användbara data från små prover
Efter att ha optimerat SMRT-Tag visade teamet att det fungerar lika bra som etablerade protokoll, men med mycket mindre mängder DNA – ungefär den mängd som finns i så få som 10 000 celler.
”Med hjälp av guldstandardmaskiner för sekvensering av enstaka molekyler har ingen någonsin sekvenserat en så liten mängd DNA till den täckning vi nu har uppnått”, säger Ramani.
Därefter kombinerade hans team SMRT-Tag med en metod som de tidigare utvecklat och som kallas SAMOSA, en förkortning för ”single-molecule adenine methylated oligonucleosome sequencing assay”.
SAMOSA avslöjar ytterligare metyleringsmönster som återspeglar kromatinets tillgänglighet – eller hur lätt genuttrycksmaskineriet kan komma åt olika DNA-sträckor.
Med det nya SAMOSA-Tag-verktyget kunde forskarna nu bedöma tillgängligheten till kromatin med mycket mindre DNA än vad som tidigare behövts. För att demonstrera metoden använde de den på prostatacancerceller – en del från patientens ursprungliga tumör och en del från en tumör som hade spridit sig till en annan plats i kroppen – som hade transplanterats och odlats i möss. Metoden avslöjade skillnader i kromatintillgänglighet som antyder möjliga nyckeldrivkrafter för metastasering av cancer.
”Det här är bara ett exempel på hur våra verktyg kan tillämpas på kliniskt relevanta prover inom cancer och andra sjukdomar där DNA är en bristvara”, säger Siva Kasinathan, MD, Ph.D., som ledde studien tillsammans med Ramani. ”Vi tror att det finns en del lågt hängande frukt där som kan låsa upp ny biologi, vilket kan vara viktigt för att hjälpa patienter på längre sikt.”
Kasinathan, som är klinisk stipendiat vid Lucille Packard Children’s Hospital vid Stanford University, är gästforskare vid Gladstone och har länge samarbetat med Ramani.
Ramanis team håller nu på att optimera SMRT-Tag och SAMOSA-Tag så att de ska fungera med ännu mindre mängder DNA. De fortsätter också att dela med sig av och regelbundet uppdatera sina protokoll online, och bjuder in andra forskare till feedback och samarbete. ”Samhället och de människor som är involverade är verkligen viktiga i berättelsen om det här arbetet”, säger Ramani.
Han lyfter särskilt fram sitt arbete med Kasinathan, som han träffade när de tillsammans gick i forskarskolan vid University of Washington. Tillsammans tog de fram konceptet för studien. ”Det har varit så meningsfullt att arbeta med en av mina närmaste vänner för att publicera vad vi tror kommer att få stor betydelse för människors hälsa.”
Ytterligare information: Arjun S. Nanda et al, Direct transposition of native DNA for sensitive multimodal single-molecule sequencing, Nature Genetics (2024). DOI: 10.1038/s41588-024-01748-0
